TEB SITOTOKSIK

TEKNIK EVALUASI AKTIVITAS

SITOTOKSIK

Sitotoksik adalah suatu senyawa atau calon onat yang bekerja dapat membunuh dan atau menghambau pertumbuhan sel yang sedang berkembang.

Hewan yang digunakan adalah fetal tikus yang berumur 17-19 hari

Penyiapan bahan :

1.      Pembuatan larutan Hank’s.

Komposisi dari larutan Hank’s adalah sebagai berikut :

NaCl                                              8000 mg

KCl                                                 400 mg

Na2HPO4                                     120.84 mg

KH2PO4                                           60 mg

Glukosa                                         1000 mg

HEPES                                            568 mg

Nano pure Water sampai 1 liter

Atur keasaman dengan NaOH 1N sampai pH 7.2

Cara pembuatan :

Semua bahan yang sudah ditimbang dengan berat terukur dilarutkan dengan nano pure water di dalam beker gelas sambil diaduk dengan magnetik stirer selama 5 menit, kemudian beker ditutup dengan plastik film. Ke dalam larutan dialirkan gas (95%O2  + 5%CO2) selama 30 menit. Kemudian diatur keasaman larutan dengan penambahan larutan NaOH 1 N sampai pH larutan mencapai 7.2. Kemudian larutan disterilisasikan dengan cara penyaringan (0.22 mm) kedalam botol medium steril. Pekerjaan penyaringan dilakukan di dalam alat Clean Bench. Larutan ini disimpan di dalam refrigator (suhu 4^oC) sebagai larutan stock. Larutan Hank’s hanya tahan dalam satu minggu dalam penyimpanan.

2. Pembuatan Medium Eagle MEM (EMEM)

Komposisi dari medium EMEM adalah sebagai berikut :

EMEM                                            9.400 mg

NaHCO3                                         2.000 mg

L-Glutamin                                        290 mg

HEPES                                            2.380 mg

Semua bahan dilarutkan dengan milli-Q water di dalam beker gelas sambil diaduk dengan magnetik stirer selama 5 menit, kemudian beker ditutup dengan plastik film. Ke dalam larutan dialirkan gas (95%O2  + 5%CO2) selama 30 menit. Kemudian larutan disterilisasikan dengan cara penyaringan (0.22 mm) kedalam botol medium steril. Pekerjaan penyaringan dilakukan di dalam alat Clean Bench. Larutan ini disimpan di dalam refrigator (suhu 4^oC) sebagai larutan stock. Medium EMEM  hanya tahan dalam satu minggu dalam penyimpanan.

3. Pembuatan larutan Formaldehid isotonis untuk fiksasi

100 ml formalin (solutio formaldehid 37%) di campurkan dengan 900 ml nano pure water. Kedalam campuran larutan ini dilarutkan 8.5 gram NaCl dengan pengadukan memakai magnetik stirer selama 5 menit.

4. Pembuatan larutan Tripan Blue (1.5 %) untuk Pewarnaan

150 mg Tripan Blue dilarutkan di dalam larutan Saline (NaCl 0.9%) dengan pengocokan menggunakan magnetik stirer selama 24 jam. Atur keasaman larutan menggunakan  larutan NaOH 1N hingga pH larutan mencapai 7.2. Larutan ini dapat digunakan dalam satu minggu.

5. Pembuatan larutan Polyethylenamine untuk coating

Larutkan 1 ml larutan Polyethylenamine 50% di dalam 100 ml larutan 0.15 M Acid Boric Buffer (pH 8.4). Larutan ini disimpan sebagai larutan stock.

Bila hendak digunakan maka larutan stock ini dapat diencerkan menjadi 1/5 kalinya dengan menggunakan larutan 0.15 M Acid Boric Buffer (pH 8.4). Kemudian disterilakan dengan cara penyaringan (0.22 mm). Kosentrasi akhir adalah 0.1 % v/v.

6. Penyalutan coverslip dengan larutan Polyethylenamine

Digunakan coverslip plastik ukuran 22 x 22 mm, kemudian dibagi menjadi 9 buah covers;ip kecil-kecil dengan ukuran 7 x 7 mm. Pengguntingan ini dapat dilakukan di luar clean bench.

Untuk pengerjaan selanjutnya harus dilakukan di dalam clean bench yaitu :

a.       Rendam coverslip dalam air steril selama 2 jam, kemudian pindahkan ke dalam etanol 70% selama 2 jam lalu dicuci cuci 3 kali dengan air steri.

b.      Kemudian direndam di dalam larutan polyethylenamine steril pH 8.4 selama satu malam di bawah sinar U.V

c.       Cuci coverslip 7 kali dengan air steril (3 kali dalam flacon, 4 kali dalam flacon dish).

d.      Letakkan coverslip dalam flacon dish (60 mm) sebanyak 15-18 buah/dish, kemudian sterilkan dan keringkan di bawah sinar U.V. selama 3 jam dengan tutup dish terbuka (blower clean bench dihidupkan)

e.       Kemudian dibungkaus dengan allumunium foil, simpan di dalam refrigator sebelum digunakan.

7. Penyalutan dasar flacon dish dengan larutan polyethylenamine

Pengerjaan dilakukan di dalam clean bench sebagai berikut

a.       Masukkan 4 ml larutan polyethylenamin 0.1% ke dalam tiap flacon dish 60 mm, kemudian disimpan semalam di bawah sinar U.V.

b.      Cuci flacon dish 7 kali dengan 5 ml air steril

c.       Kemudian flacon dish dikeringkan dan disterilkan di bawah sinar U.V. selama 3 jam dengan tutup selalu terbuka, blower/van clean bench dihidupkan

d.      Bungkus dengan alluminium foil dan simpan di dalam refrigator sebelum digunakan.

Teknik Pengujian

A. Pengeluaran fetal dan peisahan kepala

1.      Tikus dengan kehamilan 17-19 hari di anestesi dengan Nembutal (60 mg/kgBB) secara intra peritoneal.

2.      Kemudian badan tikus dibilas dengan larutan “Hibitone solution” 1% pada suhu kamar

3.      Tikus ditelentangkan di atas serbuk es yang beralaskan alluminium foil

4.      Di sekitar perut tikus didesinfeksi dengan larutan “Isodine”

5.      Buka bahagian hypogastrik dengan menggunakan gunting operasi (Anatomy scissors)

6.      Keluarkan untaian embrio, dan masukkan fetal tikus ke dalam beberapa  beker gelas yang sudah berisi larutan Hank’s

7.      Pisahkan fetal dengan pembungkusnya, masukkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi larutan Hank’s

8.      Pisahkan bahagian kepala fetal dengan memotong bahagian lehernya, masukkan ke dalam cawan petri lain yang sudah berisi larutan Hank’s

9.      Semua bahagian kepala fetal dimasukkan ke dalam tube flacon 50 ml yang berisi larutan Hank’s

B. Isolasi Cortex dan Striatum fetal

1.      Letakkan kepala fetal dalam cawan petri yang berisi larutan Hank’s dengan bahagian batok kepala sebelah atas

2.      Buka kulit kepala dengan spatel runcing

3.      Putung batok kepala dengan gunting 4 arah

4.      Keluarkan otak dengan bantuan mikro spatula

5.      Pisahkan bagian-bagian otak ke dalam cawan petri lain yang berisi larutan Hank’s

6.      Bahagian-bahagian otak dibuka di bawah stereomikroskop dengan bantuan gunting mikro untuk mengambil neuron kortek dan neuron ttriatum

7.      Pisahkan bahagian lemak, dan buang bahagian hipocampus, buang membran, lalu pisahkan bahagian striatum dan bahagian cortek kedalam masing-masing flacon 15 ml yang sudah berisi larutan Hank’s.

8.      Cuci bahagian cortek dan striatum masing-masing 10 kali dengan larutan Hank’s dalam Clean bench.

C. Pembuatan Kultur sel

1.      Setelah pencucuan dengan larutan Hank’s, bahagian kortek atau striatum diletakkan dalam cawan petri persis pada bahagian sentral

2.      Kemudian dipotong halus dengan menggunakan dua pisau tajam dengan posisi saling bersilangan

3.      Suspensikan sel hasil penghalusan dengan 5 ml larutan Hank’s, kemudian di saring

4.      Bilas lagi cawan petri dengan 5 ml larutan Hank’s, kemudian disaring kedalam filtrat 3

5.      Suspensi sel yang terkumpul disentrifuge selama 3 menit (1000 rpm), kemudian supernatan (larutan Hank’s) dibuang

6.      Sisa (sel) disuspensikan dalam 10 ml EMEM-FCS

7.      Lakukan penghitungan kerapatan sel dengan bantuan Hemasitometer, kemudian diencerkan dengan medium EMEM-FCS sampai kerapatan sel menjadi 1.5 – 1.7 X 10⁶ sel/ml

8.      Kemudian pipetkan suspensi sel tersebut ke dalam 2 cawan petri berisi 9 cover slip masing-masingnya 3 ml, lalu dieram dalam inkubator CO2 selama 24 jam

9.      Lakukan penukaran medium (medium Change) EMEM-FCS setiap 2 hari selama 6 hari, dan EMEM-HS selama 4 hari berikutnya

10.  Pada hari ke 6 (setelah medium change ke 3) ke dalam eraman sel ditambahkan larutan Ara-C sebagai faktor tumbuh.

D. Penambahan konsentrasi zat uji

1.      Untuk bahan uji yang mempunyai aktivitas kuat (efektifitas besar), ditambahkan ke dalam eraman sel beberapa jam sebelum dilakukan penghitungan sel pada hari 11 atau 12

2.      Untuk bahan uji dengan efektifitas rendah ditambahkan ke dalam eraman sel mulai dari penukaran medium (medium change) 1, ke 2 atau ke 3 (hari ke 2, 4 atau ke 6) dihitung dari mula kulturing (penanaman sel)

E. Penghitungan sel (Counting)

1.      Penghitungan kerapatan sel sebaiknya dilakukan pada hari ke 11-12  dihitung dari mula kulturing (penanaman sel), atau 12-24 jam setelah dilakukan penukaran medium EMEM-HS yang ke dua

2.      Sebelum dilakukan penghitungan sel, terlebih dahulu civer slip yang mengandung biakan sel diwarnai dengan memasukan ke dalam larutan Trypan Blue beberapa detik

3.      Pengamatan dan penghitungan sel dilakukan dibawah floresen mikroskop yang dilengkapi dengan kamera foto

4.      Sel yang mati ditandai dengan warna yang gelap setelah pewarnaan dengan larutan Trypan blue, sedangkan untuk sel yang hidup warnanya lebih terang

5.      Lakukan penghitungan jumlah sel yang mati, bandingkan persentasenya dengan perlakuakn kontrol

6.      Larutan sediaan uji sebelum ditambahkan ke dalam eraman sel, harus dilakukan sterilisasi secara penyaringan di dalam clean bench