Penentuan pyrogen

Penentuan pyrogen

è Pyrogen atau pyrogenitas

a.    Penentuan pyrogen secara fisiko kimia. (kuantitatif pyrogen)

1.     Dengan fotokolorimetri, reagen Tetrabrom phenolphtalein. (TBP). Dengan penambahan asam acetat 0,2 N, sehingga timbul warna.

2.     Polarografi.

Pyrogen mepunyai panjang gelombang maksimum oksigen pada polarografi.

3.     Elektroforesis.

4.     Spektrofotmetri.

Pyrogen mempunyai absorbsi spktrum ultraviolet pada E maksimum 265 mm.

     b. Penentuan pyrogen secara biologis

(kwalitatif dari pirogenitas).

Tahap :

i.      Pengujian pengukuran temperatur badan hewan percobaan.

Persiapan :

Hewan percobaan :

-          Efek pyrogen tidak hanya ditentukan oleh pyrogen itu, tetapi juga oleh spesies penerima injeksi.

-          Hewan percobaan : Kelinci himalaya putih (sensitifitas tinggi terhadap pyrogen)

-          Tempat penyuntikan I.V. pada telinga kelinci

-          Syarat (Ph. Ind. III): Kelinci yang digunakan, haruslah selama seminggu sebelum pengujian tidak menunjukkan penurunan berat  badan .

Kelinci yang tidak dapat digunakan adalah :

a.    Tiga hari sebelumnya telah digunakan untuk uji pyrogenitas dan hasil negatif.

b.    Tiga minggu sebelumnya telah digunakan untuk uji pyrogenitas, tidak memenuhi syarat.

c.    Telah digunakan kapan saja untuk uji pyrogenitas dan respon rata-rata kelompok kelinci melebihi 1,2⁰.

Alat :

Termometer yang dipakai ketelitian 0,1 ⁰  dan dapat memasuki dubur kelinci ±5 cm.

Jarum terbuat dari kaca atau bahan lain yang cocok, tahan pemanasan 250⁰.

Sediaan Uji :

zat uji diencerkan dengan larutan NaCl P steril bebas pyrogen.

Prosedur Kerja

1.    kelinci dimasukkan ke kotak dengan penahan leher yang cukup longgar, badan bebas, kelinci dapat duduk dengan bebas.

2.    Uji pendahuluan :  

Satu sampai tiga hari sebelum pengujian,

suntik kelinci masing-masing dengan 10 ml/kgBB dengan larutan NaCl P steril bebas pyrogen.

Ø  Ruang harus tenang, di ruang dengan perbedaan terhadap temperatur pemeliharaan tidak boleh lebih dari 3 ⁰C.

Ø  1 malam hingga pengujian selesai kelinci tidak diberi makan dan selama waktu pengujian tidak diberi minum.

Ø  Catat temperatur badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga tiga jam sesudah penyuntikan dengan larutan NaCl P steril  bebas pyrogen.

Ø  Kelinci yang menunjukkan beda temperatur lebih besar dari 0,6 ⁰C tidak dapat digunakan untuk pengujian utama.

3.    Pengujian utama.

Ø  1 kelompok hewan percoban terdiri dari 3 ekor kelinci.

Ø  Hangatkan sediaan uji hingga temperatur  ± 38,5 ⁰C.

Ø  Suntikan perlahan-lahan ke dalam vena auricularis  tiap kelinci.

Ø  Lama penyuntikan tidak lebih dari 4 menit dan volume sediaan uji tidak kurang dari 0,5 ml dan tidak lebih dari 10 ml per kg bobot badan.

Ø  Jika gagal, ulangi pengujian hingga 4 kali, tiap kelompok uji terdiri dari 3 ekor kelinci.

4.    Penafsiran hasil.

Ø  Temperatur awal adalah temperatur rata-rata 2 pembacaan temperatur dengan interval 30 menit dan dilakukan 40 menit sebelum penyuntikan sediaan uji.

Ø  Temperatur maksimum adalah temperatur tertinggi yang dicatat selama 3 jam setelah penyuntikan sediaan uji.

Ø  Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimula 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam setelah penyuntikani.

Ø   Selisih temperatur awal dengan temperatur maksimum tiap kelinci dinyatakan sebagai temperatur respon. Jika temperatur respon negatif, dianggap nol.

Kelinci memenuhi syarat.

-          Bila antar kelinci perbedaan suhu  awal tidak  lebih dari 1⁰  C.

Kelinci tidak memenuhi syarat:

-          Perbedaan temperatur awal lebih besar dari 0,2 ⁰C.

-          Temperatur awal lebih kecil dari 38,0 ⁰C dan tidak lebih besar dari 39,8 ⁰C.

Sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat :

-          Jika jumlah respon tidak melebihi kolom 2 dan dinyatakan tidak memenuhi syarat jika jumlah respon melebihi kolom 3 untuk tiap kelompok.

-          Jika jumlah respon terletak antara kolom 2 dan kolom 3, pengujian diulangi.

-          Jika pengujian keempat jumlah respon melebihi 6,6⁰ C sediaan uji dinyatakan tidak memenuhi syarat.

Tabel 2. Persyaratan hewan untuk uji pyrogenitas

Jumlah kelinci	Sediaan uji memenuhi syarat bila respon tidak melebihi	Sediaan uji tidak memenuhi syarat jika jumlah respon melebihi
3 6 9 12	1,20 2,80 4,50 6,60	2,7 4,30 6,00  6,60

ii.  Perhitungan sel darah putih.

Injeksi obat suntik yang mengandung pyrogen pada pembuluh balik darah kelinci akan menyebabkan terjadinya perobahan sel-sel darah putih.

Mis ; penurunan lympocyte dan menaikan neutrophyls. ini menjadi  indikator terhadap adanya aktivitas pyrogen.

iii. Test limulus.

Prinsip : pengumpalan ekstrak cair sel darah kepiting ladam kuda (limulus polyphemus)  dengan adanya pyrogen. 

Limulus poliphemus,

Ø  Cairan limpha atau darahya mengandung 1 jenis sel-sel yang beredar dan disebut Amoebocyten.

Ø  Amoebocyten mudah hancur dan mengandung protein yang dapat menggumpal (Procoagulantin).

Tahun 1885,

Ø  Howelel menemukan sifat-sifat koagulasi dari limulus lysate ini

Ø  diteruskan oleh Loeb.

Ø  Beberapa tahun berikutnya, Bang, dkk,  memperlihatkan bahwa bakteri gram negatif bereaksi dengan darah intravascular kepiting tersebut dan ekstrak sel darah dari kepiting sangat sensitif terhadap endotoksin bakteri gram negatif.

Ø  Levin – Bang dan Reinhold Fine adalah yang pertama kali menulis metoda in –vitro untuk penentuan endotoksin berdasarkan kerja Bang. à Metoda LAL Test

LAL test merupakan metoda yang sensitif untuk penentuan endotoksin bakteri gram negatif atau lipopolisakharida (pirogen),

Ø  dimana lipid A dari molekul endotoksin dapat memberikan reaksi menjadi gel dari  limulus lysate.

Ø  Ada kecocokan atau persamaan hasil antara LAL dengan test kelinci.