TEKNIK EVALUASI AKTIVITAS SARAF

TEKNIK EVALUASI AKTIVITAS SARAF

Aktivitas saraf dapat dilakukan dengan melihat atau merekam sinyal yang dihantarkan oleh saraf tersebut ke dalam transduser yang dapat diterjemahkan dalam satuan mV/detik, dengan menggunakan soft ware LabIEW sistem. Banyak aktivitas saraf bisa diamati. Sebagai protokol akan dijelaskan penentuan aktivitas saraf simpatik ginjal pada tikus.

Hewan Percobaan

Untuk penetuan aktivitas saraf dapat digunakan hewan percobaan tikus atau kucing.

Bahan

Natrium klorida                                         (AnalaR, BDH Lab., UK)

Heparin                                                     (Leo Pharmaceutical)

Fluothane                                                  (Zeneca, UK)

Urethane                                                   (Sigma Chemical & Co. USA)

Borax                                                        (Sigma Chemical & USA)

a-Chloralose                                             (Sigma chemical & Co. USA)

Wacker RTV-2E 604 A                              (Wacker-Chemie GmbH Muncen).

Wacker RTV-E 604 B                                            (Wacker-Chemie GmbH Muncen)

Alat-alat

Perfusor secura, FT 50 ml                   (B.Braun, Germany)

Small animal ventilator                       (Harvard)

Lampu focus                                       (SCHOTT KL 1500 electronic)

Stemi SV 6 Microscope                      (ZEISS, Germany)

Grass tranducer                                   (Gold P23 ID Statham, USA)

CEC instrumentation                          (Birmingham, UK)

Amplifier instrumentation                   (Birmingham, UK)

Software LabVIEW                           (A/D National Instruments, USA).

Desktop komputer                              (Apple Macintosh)

Triple beam balance                            (700 “OHAUS SCALE CORPORATION”)

“Stat Fax ^TM                                        (Awareness Tech., Inc.)

Weitlaner BV 76                                 (Esqulap)

Penyediaan Larutan Pembius Kloralose-Uretan

Campuran kloralos (120 mg), boraks (120 mg) dan natrium klorida (90 mg) dilarutkan dalam 3 ml air suling panas suhu 70^O C (larutan 1.). Uretan (1800 mg) dilarutkan pula di dalam 5 ml air suling panas suhu 70^O C (larutan 2.). Kedua larutan ini dicampurkan dan diaduk hingga larut dengan sempurna. Kemudian ditambahkan Air suling panas sehingga volume menjadi 10 ml, dan dibiarkan sehingga larutan ini mencapai suhu kamar (Zhang & Johns, 1997).

Pengukuran Aktivitas Saraf Simpatik Ginjal

Saraf simpatik yang diukur aktivitasnya ialah saraf simpatik ginjal kiri. Sinyal simpatik yang keluar dari saraf ginjal kiri setelah dibesarkan dengan amplifier akan terakam secara automatik (mV/s.) melalui komputer Apple Macintosh menggunakan software LabVIEW. Data diberikan dalam bentuk purata.

Tatacara pembedahan hewan

Pada hari percobaan tikus dimasukkan ke dalam kontainer plastik dan dibius menggunakan campuran “fluotane” dan oksigen dengan kecepatan aliran masing-masingnya 5 L/minit dan 4 L/minit selama 2 minit. Tikus yang telah terbius sempurna dipindahkan ke meja pembedahan, dilanjutkan pembiusan dengan kecepatan aliran pembius yang sesuai. Bulu tikus bahagian leher, bahagian lipat paha kanan atas dan bahagian kiri punggung dicukur dan dibersihkan menggunakan mesin cukur listrik. Tikus ditelentangkan di atas papan bedah dan keempat kakinya diikatkan ke papan bedah untuk membatasi pergerakannya. Untuk memberi pernafasan spontan pada tikus dilakukan tracheotomi dengan cara berikut: Sedikit kulit dibahagian leher dibuang dan otot di atas trakea dipisahkan sehingga jelas kelihatan 2 sm trakea. Trakea dipotong setengahnya dan kanula berukuran garis tengah bagian dalam  1.77 mm dan garis tengah bagian luar 2.80 mm (PE 260) dimasukkan ke dalamnya, dan diikat dengan benang supaya tidak mudah lepas.

Vena femoral kanan dikanulasi dengan cara sebagai berikut: Sedikit kulit bahagian lipat paha kanan tikus dibuang, kemudian  vena femoral 1.5 sm dibersihkan secara hati-hati dan dipisahkan dari tisu-tisu penghubung. Bahagian distal vena femoral diikat dengan seutas benang dan bahagian proksimal jepit dengan forsep agar darah tertahan mengalir. Sebahagian vena dipotong, kemudian kanula berukuran garis tengah dalam 0.58 mm dan garis tengah luar 0.95 mm (PE 50) yang berisi larutan salin dimasukkan ke dalam vena dan diikat dengan seutas benang. Infusi salin (NaCL 0.9%) diberikan melalui vena, untuk mempertahankan pembiusan dilanjutkan dengan pemberian campuran kloralos/ uretan (12 mg dan 180 mg/ml), 0.1 ml setiap 5 min (6-7 kali pemberian), kemudian dilanjutkan dengan 0.05 ml setiap 30 minit sesuai dengan keperluan. Sewaktu percobaan berlangsung, tikus diberikan infus salin  melalui vena femoral kanan dengan kecepatan aliran 3 ml/jam.

Arteri femoral yang berada sejajar dengan vena femoral kanan dikanulasi dengan cara berikut: Arteri femoral dibersihkan secara hati-hati dan dipisahkan  dari tisu-tisu penghubung, Bahagian distal arteri femoral diikat dengan seutas benang dan bahagian proksimal pula diangkat dengan pinset agar darah tertahan mengalir. Dipotong sebahagian arteri, kemudian kanula PE 50 berisi campuran larutan salin dan heparin (60 U/ml) dimasukkan ke dalam arteri dan diikat dengan seutas benang. Ujung kanula yang lain disambungkan langsung kepada transduser tekanan darah (“Grass” transducer) untuk mengesan isyarat tekanan darah dan laju jantung. Transduser tekanan dihubungkan kepada  “CEC instrumentation” dan amplifier, kemudian dihubungkan seterusnya kepada komputer “Apple Macintosh” untuk merekamkan data secara otomatik menggunakan soft ware LabVIEW.

Untuk pengeluaran urin spontan pada tikus percobaan, pundi kencing (bladder)  dikanulasikan dengan cara berikut: Sebahagian pundi kencing dipotong untuk memasukkan kanula berukuran garis tengah dalam 0.86 mm dan garis tengah luar 1.52 mm, kemudian diikat dengan benang. Urin yang dihasilkan ditampung dengan sebuah tabung.

Pembedahan pada bahagian punggung (“retroperitoneal”) tikus dilakukan dengan cara berikut : Bahagian epidermis belakang kiri tikus (yang sudah dibuang bulunya) digunting sejajar tulang belakang sepanjang 6-7 sm. Kemudian dipisahkan  bahagian otot belakang tikus dari tisu-tisu penghubung secara hati-hati hingga ginjal, vena dan arteri ginjal terlihat dengan jelas. Bahagian perut dipisahkan dari otot belakang tikus menggunakan alat tisu spreader (Weitlaner BV 76). Saraf simpatik ginjal (dilihat dengan bantuan mikroskop) dibersihkan dari tisu-tisu penghubung secara hati-hati, kemudian dipisahkan. Saraf simpatik ginjal yang telah terpisah  dikait dengan bantuan spatel gelas yang tumpul, lalu diletakkan di atas elektroda perak, dan dilrekatkan dengan Wacker Sil Gel 604 (Wacker-Chemie, Munich, Germany). Perekat Wacker Sil Gel 604 dibuat segera dengan cara mencampurkan 9.9 ml Wacker RTV-2E 604 A dengan 0.1 ml Wacker RTV-E 604 B dalam tiub, dipanaskan dengan suhu 60⁰ C sambil diaduk sampai jernih, kemudian dibiarkan sampai suhu badan untuk dapat digunakan.

Sinyal saraf simpatik ginjal (RSNA) yang diterima oleh elektrod perak dihubungkan kepada  “CEC instrumentation” dan amplifier, kemudian dihubungkan seterusnya kepada komputer “Apple Macintosh” untuk merekamkan data secara automatik menggunakan perisian LabVIEW (A/D National Instruments, Austin, Texas, USA).

Selesai pembedahan, tikus diberi 2 ml larutan salin sebagai kelengkapan dan diikuti oleh infus salin sepanjang percobaan dengan kecepatan aliran  3ml/jam. Tikus diistirahatkan selama 2 jam untuk kestabilan dan menghilangkan rasa tekanan (stress) pada tikus percobaan akibat dari proses pembedahan (Zhang & Johns, 1996).

Cara Pencatatan Data Percobaan

Data tekanan darah, kadar jantung dan aktivitas saraf simpatik ginjal untuk setiap tikus dicatat dengan menekan tombol “Clearance” pada layar monitor komputer dalam setiap percobaan. Semua data adalah dalam purata dari SBP dan DBP (mmHg), HR (Hz) dan RSNA (mV/s) dalam waktu 3.5 minit akan dirakam secara otomatik dalam bentuk tabel di dalam komputer.

Pengaruh suara latar (background noise level) dari RSNA untuk setiap tikus perlu dirakamkan  30 minit setelah tikus dimatikan. Garis dasar RSNA  untuk setiap tikus percobaan adalah nilai RSNA yang dicatat sewaktu percobaan berlangsung dikurangi dengan nilai suara latar yang dircatat di akhir percobaan (Zhang & Johns, 1996; 1997).

Analisa Data

Data untuk semua  kelompok tikus dinyatakan dalam min ± s.e.m.  Data percubaan dianalisis secara statistik dengan sistem Anova satu arah, Anova dua arah dan dilanjutkan dengan Duncan’s post-hoc test dengan program SUPER ANOVA (Abacus Inc., 1985). Nilai keberartian P<0.05 dianggap signifikan