VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR SECARA KCKT

VALIDASI METODE ANALISIS

PENETAPAN KADAR SECARA KCKT

I. Tujuan

Untuk membuktikan melalui pengujian laboratorium bahwa karakteristik metoda penetapan kadar dengan KCKT ( kromatografi cair kinerja tinggi ) sesuai dengan tujuan analisisnya, sehingga didapatkan hasil analisis yang absah, dapat dipercaya, dapat dipertanggung jawabkan dan sesuai tujuan.

II. Ruang lingkup

Dilakukan untuk metoda analisis KCKT yang dilakukan di laboratorium bila dilakukan terhadap prosedur untuk sintesa bahan baku, komposisi produk obat dan lain-lain.

III. Tanggung Jawab

-          Tenaga terlatih dan bertanggung jawab terhadap pelaksanaan analisis bertanggung jawab melakukan validasi dan mencatat semua informasi data yang diperoleh dari pelaksanaan validasi.

-          Supervisor bertanggung jawab merencanakan validasi, menulis protokol, mengawasi kinerja dan memastikan kelengkapan catatan anlisis.

-          Pemastian mutu bertanggung jawab mengkaji dan menyetujui protokol sebelumnya dilaksanakan validasi.

IV. Bahan, Peralatan dan Dokumen

-          Protab dan format untuk pencatatan dan data penetapan kadar yang dilakukan.

-          Bahan dan peralatan sesuai dengan yang tertera pada protab.

-          Dokumen yang menyatakan bahwa peralatan yang telah digunakan telah dikalibrasi.

V. Prosedur

Penentuan parameter validasi KCKT untuk pengujian metoda analisis yang akan dilakukan

Parameter validasi KCKT

1. Presisi (ketelitian / kereksamaan).
2. Akurasi (ketepatan / kecermatan).
3. Sensifitas (LOD dan LOQ).
4. Spesifisitas / selektualitas.
5. Linearitas
6. Range (rentang)
7. Rugedness (kekasaran)
8. Robustness (ketahanan)

1. Presisi

            Merupakan kedekaran hasil uji yang diperoleh dari beberapa pengulangan (replikasi) pada penetapan contoh yang sama (homogen).

            Cara penentuan

            Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relative (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeability) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan metoda jika dilakukan berulang kali oleh analisis yang sama pada kondisi yang sama dan dalam interval waktu yang pendek.

-          Presisi sistem (replitabilitas)

Penyuntikan berulang minimum 6 kali dari contoh homogen untuk menunjukkan kinerja alat pada kondisi dan hasil pengujian.

-          Presisi metoda (repeatabilitas)

Minimum 3 konsentrasi analit dalam rentang tertentu, masing–masing 3 replikasi atau minimum 6 penetapan pada pengujian 100%

Kriteria seksama diberikan jika metoda memberikan simpangan baku (SB) atau koefisien variasi 2% atau kurang.

2. Akurasi / ketepatan

            Merupakan kedekatan hasil uji yang diperoleh (menggunakan metode yang sedang validasi) dengan nilai sebenarnya yang terdapat dalam contoh uji.

Akurasi biasanya dalam persen recovery.

Metoda penerapan akurasi :

a.       Recovery analit : untuk contoh yang komposisinya diketahui.

b.      Standar adisi : untuk contoh yang komposisinya tidak diketahui.

c.       Membandingkan hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode yang telah valid.

Cara penetapan akurasi :

a.       Recovery analit dan metoda standar adisi

Minimum 3 konsentrasi analit / baku pembanding yang ditambahkan dalam rentang (80-120)%, masing-masing 3 replikasi.

b.      Perbandingan metoda

Minimum 6 kali pengujian menggunakan metoda analisis yang sedang divalidasi dan 6 kali pengujian menggunakan metode standar atau metode resmi.

Hasil akurasi yang masih dapat diterima :

nomor	Kosetrasi analit dalam matrik contoh	Rentang % recovery
1	100%	98 – 102
2	≥ 10%	98 – 102
3	≥ 1%	97 – 103
4	≥ 1000 ppm	95 – 105
5	≥ 100 ppm	90 – 107
6	≥ 10 ppm	80 – 110
7	≥ 1 ppm	80 – 110
8	≥ 100 ppb	80 – 110
9	≥ 10 ppb	60 – 115
10	≥ 1 ppb	40 – 120

           

            Recovery ditentukan menggunakan rumus :

                        Recovery =  Hasil analisis       x 100%

                                          Nilai sebenarnya

                        Syarat recorvery = 98% - 102,0%

3.Sensitifitas

1.      Batas deteksi (LOD)

Kadar terendah analit dalam contoh yang masih dapat dideteksi namun tidak harus kuantitatif.

2.      Batas kuantisasi (LOQ)

Kadar terendah analit dalam contoh yang masih dapat diterapkan kadarnya dengan presis dan akurasi yang masih dapat diterima.

Cara penentuan sensitifitas

-          Prosedus non instrumen

Contoh dengan konsentrasi yang diketahui dilakukan analisa melalui visual.

-          Prosedur instrument :

Rasio signal to noise : membandingkan hasil uji contoh yang mengandung analit dengan kadar rendah terhadap hasil uji blanko.

            LOD = 3 x noise                     LOQ = 10 x noise

Berdasarkan simpangan baku respon analit slope kurva kalibrasi :

a.       Batas deteksi dan batas kuantisasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran blanko akan dengan nilai b pada persamaan pada garis linier  y = ax + b, sedangkan simpangan blanko sama dengan simpangan baku residual S _y/x

Batas deteksi              (Xd) = Y – b         karena     Y = b + 3S_y/x

                                                    a

                                     (Xd) = 3 S_y/x

                                                   a

Batas kuantisasi          (Xk) = 10 S_y/x

                                                    A

Dengan kedua persamaan tersebut LOD & LOQ tergantung pada nilai b yang menggambarkan galat sistemis. Jika nilai b<0 maka persamaan garis liniernya y = ax - b

b.      Batas deteksi dan batas kuantisasi akan lebih besar yang berarti metoda analisis kurang baik (kepekaanya kurang)

Batas deteksi  (Xd)

            Xd = 2b + 3 S_y/x

                            a

Batas kuantisasi (Xk)

            Xk = 2b + 3 S_y/x

                            a

4. Spesifitas / selektifitas

-          Spesifitas : kemampuan metoda analisis membedakan suatu analit yang ditetapkan dalam komponen lain yang berada dalam komponen contoh.

-          Selektifitas : kemampuan metode analisis memberikan sinyal analit pada campuran analit dalam contoh tanpa adanya interaksi antar analit.

-          Metoda selektif merupakan seri metode spesifik.

-          Prosedus spesifitas tergantung pada tujuan penggunaan prosedur analisis.

Cara penentuan :

-          Selektifitas metoda ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya.

-          Jika cemaran dan hasil urai tidah dapat diidentifikaiskan atau tidak dapat diperoleh, maka selektifitas ditunjukkan dengan menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan hasil metode lain untuk pengujian kemurnian, melalui perhitungan daya resolusinya (RS)

Pemisahan dua puncak yang berdekatan dalam kromatogram :

R = 2 (t₂ – t₁ )

         w_{2 +}w₁

t₂ = waktu retensi komponen 2

t₁ = waktu retensi komponen 1

w₂ = lebar puncak komponen 2

w₁ = lebar puncak komponen 1

Komponen pertama dan komponen kedua diukur dengan jalan ektopolarisasi puncak yang relatif lurus sampai garis datar (besar line)

Resolusi harus lebih besar dari 1,5

5. Linearitas

            Merupakan kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang sebanding atau berbanding lurus terhadap konsentrasi analit dalam contoh pada kisaran tertentu.

Cara penetapan :

-          Ditetapkan terhadap minimal 6 konsentrasi pada rentang 50 – 150% dari kadar analit.

-          Hitung regresi linier demana garis regresi : y = ax + b

b = kemiringan (slope) garis regresi

a = perpotongan dengan garis sumbu y

Koefiseien korelasi r ≥0,98

6. Rentang

            Kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar analitnya masih linier dengan presisi dan unkuran yang masih dapat diterima.

Cara penentuannya:

-          Dibuat kurva regresinya dan ditentukan batas batas bawah dan batas atas dari kadar analit yang masih memberikan garis linier.

7. Ruggedness / kekasaran

            Kemampuan untuk memberikan hasil uji yang sama pada contoh yang sama, tetapi keragaman kondisi pengujian berbeda.

Cara penetapan :

-          Melakukan uji kolaborasi antar labor, dan dibandingkan presisi dan akurasi dari hasil uji antar laboratorium tersebut.

8. Robustness / ketahanan

            Ukuran kemampuan metoda untuk tidak tepengaruh oleh perubahan kecil dari parameter metoda yang sengaja dibuat.

Cara penentuan :

-          Membandingkan presisi dan akurasi hasil yang diperoleh dengan hasil yang dilakukan pada kondisi normal.

Tabel Persyaratan Validasi KCKT

nomor	Parameter validasi	Indikator	Kriteria penerimaan
1	Spesifitas	Resolusi antara 2 puncak yang berdekatan	Tidak kurang dari 1,5
2	Akurasi	Persen recovery	98% - 102%
3	Presisi	Simpangan baku relatif  (SBR)	Tidak lebih 2%
4	Linearitas	Hubungan yang linier antara respon analisis dan konsentrasi analit dalam rentang penggunaan mtode analisis	- Garis regresi -    Koefisien kolerasi ≥0,98
5	Rentang	Memenuhi syarat akurasi dan presisi dalam rentang analisis	SBR ≤ 2% Recovery 98% -102%
6	Ketegaran	Memenuhi persyaratan akurasi dan presisi dalam rentang variabilitas internal parameter metoda analisis, seperti perbedaan tipe dan merek instrumen, perbedaan merek reagensia, dan perbedaan fase gerak, perbedaan analisis yang melakukan analisis dan perbadaan haisl uji, tapi pengujian dilakukan dalam laboratorium yang sama.	SBR ≤ 2 % Recovery 98% -102%
7	Kesesuaian sistem	Resolusi, SBR hasil penyuntikan enam kali larutan baku pambanding, Faktor ikutan Lempang teoritis Faktor kapasitas kolom Waktu retensi relatif	T ≤ 1 % N ≥ 1000 Rf ≥ 2 Nyatakan dalam prosedur analisis.

LAMPIRAN

Validasi Metoda Analisis KCKT

1. Kecermatan

1. Metoda            : spiked-plasebo
2. Rentang           : 50 – 150 % dari yang diharapkan
3. Data analisis

matrik sampel  :..........................

4. Hasil analisis :

percobaan	Konsentrasi lrtn simulasi	Konsentrasi yang ditemukan	% perolehan
1
2
3
4
5
6
			KV =

% perolehan hasil kembali rata-rata =....%

      Koefisien rata-rata                      =....%

      Kriteria termal                             =

2. Kecermatan

            Data analisis :

1. Komposisi matrik        =.........
2. Pelarut pengekstraksi  =.........
3. Hasil analisis :

Sampel	Kadar µl/ml	Luas puncak (A)
		KV =

3. Linearitas dan rentang

            Data analisis    : .........................

            Kadar              : .........................

nomor	Konsentrasi µg / ml	Luas puncak (A)

Kurva kalibrasi:

                                    A   

 

                                                Konsentrasi (µg/ml)

            Persamaan garis           = ...........

            Koefisien kolerasi       = ...........

            Batas deteksi               = ...........

            Batas kuantisasi          =............

4. Uji kesesuaian sistem

a.       Faktor ikutan :

T_f  = w_0,05

          2f

b.      Faktor resolusi

R_s = 2 ( Rt₂ – Rt₁ )

            w₁ + w₂

c.       Keseksamaan penyuntikan

No suntikan	Luas puncak	Waktu retensi
1
2
3
4
5
6
Rata – rata = ................ SD             = ................. % KV        = ................